Ativação

Biologia das Comunicações volume 6, Número do artigo: 604 (2023) Citar este artigo

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A terapia com células CAR T é uma área em rápido crescimento de tratamentos oncológicos com potencial para se tornar o tratamento padrão para múltiplas indicações. Coincidentemente, a tecnologia de edição de genes CRISPR/Cas está entrando na fabricação de produtos de células CAR T de próxima geração com a promessa de uma metodologia de modificação celular mais precisa e controlável. A interseção desses avanços médicos e moleculares cria uma oportunidade para maneiras completamente novas de projetar células modificadas para ajudar a superar as limitações atuais da terapia celular. Neste manuscrito, apresentamos dados de prova de conceito para um loop de feedback projetado. Fabricamos células CAR T induzidas por ativação com a ajuda da integração direcionada mediada por CRISPR. Este novo tipo de células T modificadas expressa o gene CAR dependente de seu estado de ativação. Este artifício abre novas possibilidades para regular a função das células CAR T tanto in vitro como in vivo. Acreditamos que esse sistema de controle fisiológico pode ser uma adição poderosa à caixa de ferramentas atualmente disponível das construções CAR de próxima geração.

Células T geneticamente modificadas que expressam Receptor de Célula T modificado (TCR) ou Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) são ferramentas poderosas para tratar tumores malignos1. Até hoje, várias terapias com células CAR T contra distúrbios hematológicos foram aprovadas, com uma infinidade de outras sendo avaliadas em ensaios clínicos2. Todos os produtos comerciais atuais usam a entrega de genes baseada em vetores virais3. Embora seja uma estratégia bem estabelecida e relativamente segura, ela possui algumas limitações significativas. Mecanisticamente, os vetores virais contemporâneos dependem da integração semi-aleatória descontrolada. Embora a segurança dos vetores virais seja comprovada pelo número crescente de pacientes tratados com produtos de células CAR T e a segurança da entrega do gene viral tenha sido aceita pelas agências de saúde, o risco inerente de mutagênese insercional permanece uma questão não resolvida4,5,6. Portanto, a fabricação de células T de próxima geração visa usar métodos de edição de genes melhor controlados, como CRISPR/Cas. O CRISPR/Cas permite a integração precisa do gene direcionado em um local predefinido dentro do genoma7. Isso, por sua vez, não apenas torna o procedimento de edição mais preciso, mas também abre uma oportunidade de aproveitar o local de integração do gene.

Até o momento, todos os cassetes do gene CAR usados ​​clinicamente são conduzidos por promotores artificiais fortes e constitutivamente ativos, substituindo a regulação transcricional dinâmica que ocorre em um ambiente fisiológico com impacto direto na cinética de ativação, fenótipo e sobrevivência8. A expressão contínua do CAR pode levar à exaustão e à funcionalidade do CAR abaixo do ideal in vivo9. A tecnologia CRISPR/Cas permite a transferência de genes a jusante de qualquer promotor endógeno, reduzindo assim a necessidade de promotores modificados ou externos e focando em modificações celulares mais fisiológicas8,10. As regiões promotoras nativas permitem a transcrição de genes altamente regulada. Os padrões complexos de sequência canalizam pistas reguladoras de intensificadores distais e suas proteínas moduladoras associadas levam a uma transcrição distinta11. Preservar a sofisticada regulação genética fisiológica pode ajudar a projetar produtos celulares diferenciados. Foi demonstrado que um melhor direcionamento de CARs e TCRs modificados traz benefícios claros para a potência e função das células T editadas, inserindo genes artificiais sob controle de promotores endógenos de TCR, proporcionando assim uma expressão gênica (trans) mais fisiológica12.

Além disso, uma estratégia de edição bem projetada pode aumentar a precisão da morte mediada por CAR. As células CAR T são muito potentes na lise de células que expressam o antígeno alvo (por exemplo, CD7, CD19 ou BCMA), mas não distinguem entre células saudáveis ​​e anormais13,14,15. Assim, após realizar sua tarefa inicial de eliminação do tumor, as células CAR T continuam atacando todas as células que expressam seu antígeno cognato16. Várias abordagens para contornar esses efeitos colaterais fora do tumor no alvo de células CAR T persistentes foram propostas. Por exemplo, as células CAR T podem ser erradicadas após a eliminação completa do tumor pela administração sistêmica de anticorpos direcionados contra um "interruptor de morte" sintético co-expresso nas células CAR T, levando à recuperação completa e persistente das células B17. Outra opção é a expressão transitória de CAR baseada em mRNA, que redireciona as células T contra as células-alvo apenas enquanto o mRNA for fornecido sistemicamente18,19. No entanto, essas abordagens têm desafios de abordar a cinética de distribuição, precisão, penetrância e persistência de moléculas aplicadas.